Le cellule stromali mesenchimali immunomodulatorie derivate dall'amnios preservano la funzione muscolare in un modello murino di distrofia muscolare di Duchenne

Punti principali e risultati:

Questo è uno studio sugli animali. Nessun paziente è stato trattato. Un gruppo giapponese dell’Università di Tokyo, della Nippon Medical School e di Kaneka Corporation ha somministrato cellule stromali mesenchimali umane derivate dall’amnios (hAMSC) a topi mdx, il modello murino standard della distrofia muscolare di Duchenne, tramite iniezioni ripetute nella vena della coda, e ha seguito i topi fino a un anno.

Per una famiglia che valuta un trattamento, l’articolo mostra che queste cellule calmano il sistema immunitario in laboratorio spingendo i macrofagi verso il tipo antinfiammatorio M2, che le dosi endovenose ripetute sono state tollerate dai topi e hanno ridotto l’infiammazione muscolare, e che i topi trattati hanno mantenuto più forza di presa, hanno corso più lontano e avevano una funzione cardiaca leggermente migliore a un anno. Non dimostra che nulla di tutto questo avvenga nei bambini. Le cellule erano derivate dall’amnios, non dal cordone ombelicale come quelle usate nel nostro programma, e non hanno ripristinato la distrofina, la proteina mancante che causa la malattia. Le cellule sono state fornite da Kaneka Corporation, che ha finanziato in parte il lavoro e impiega quattro degli autori.

Obiettivo:

Verificare se le hAMSC polarizzano i macrofagi umani verso il tipo M2 e se l’iniezione sistemica ripetuta di hAMSC, somministrata precocemente nella malattia, migliora la funzione del muscolo scheletrico e cardiaco nei topi mdx.

Metodi:

Cellule. L’amnios è stato prelevato, con consenso, dalle membrane fetali di donne sottoposte a parto cesareo. Le cellule sono state isolate per digestione enzimatica, espanse, congelate e usate tra i passaggi 1 e 5. Presentavano i consueti marcatori delle MSC (CD73, CD90, CD105), non avevano CD45, CD34, CD14, CD11b, CD19 e HLA-DR e in coltura formavano osso e cartilagine ma non grasso.

Lavoro di laboratorio. Cellule mononucleate del sangue umano sono state co-coltivate con hAMSC in rapporto 20 a 1 e i marcatori dei macrofagi sono stati misurati con citometria a flusso e qPCR, con indometacina usata per bloccare la prostaglandina E2 (PGE2).

Animali. Topi mdx maschi con background C57BL/10 sono stati suddivisi in modo casuale in gruppi di controllo e trattati. Ogni dose era di 8,0 × 10⁵ hAMSC in 100 µL di soluzione fisiologica nella vena della coda, una volta a settimana, a partire dalle 4 o 5 settimane di età. Il braccio a breve termine ha ricevuto quattro dosi (n = 10, valutati a 12 e 18 settimane di età, contro 14 topi mdx di controllo e 7 topi wild-type). Il braccio a lungo termine ha ricevuto quattro dosi (n = 6) o sei dosi (n = 4) ed è stato valutato a un anno contro 12 topi mdx di controllo e 7 topi wild-type. Molti esiti sono stati misurati in sottogruppi da 3 a 8 topi, indicati di seguito. L’esito principale prespecificato era la funzione motoria a lungo termine (forza di presa degli arti anteriori e velocità di corsa); l’istologia era secondaria. Gli sperimentatori non potevano essere in cieco rispetto al ceppo dei topi; la corsa è stata registrata con una ruota automatica per cinque giorni. I dati sono stati esclusi quando un topo aveva perso peso, era ferito o debilitato, o quando un valore era considerato anomalo.

Risultati:

Effetti immunitari in vitro. Le hAMSC hanno ridotto la proliferazione dei linfociti T attivati dal 90,1% al 59,9% (p inferiore a 0,0001) e hanno secreto PGE2. La quota di cellule CD206-positive (M2) è aumentata in modo modesto, dall’11,3% al 14,2% (p = 0,035), mentre le cellule M1 non sono cambiate. L’indometacina ha annullato l’aumento di CD206, indicando la PGE2 come mediatore.

Tollerabilità. Il peso corporeo non differiva tra i topi mdx trattati e non trattati in nessun momento. Non sono riportate altre misure di sicurezza (esame degli organi, ricerca di tumori, reazione immunitaria alle cellule umane).

A breve termine (da 12 a 18 settimane di età, quattro dosi):

• La creatinchinasi sierica, il marcatore di fuoriuscita dal muscolo, era più bassa quattro settimane dopo l’ultima dose (435 ± 79 contro 583 ± 92 ng/mL, p = 0,038, n = 6 contro 4) ma non a dieci settimane (582 contro 700 ng/mL, p = 0,228). Gli autori la definiscono transitoria.
• IL-6 nel muscolo tibiale anteriore: 10,0 ± 3,8 contro 94,2 ± 64,1 pg/mL (p = 0,002, n = 4 contro 5).
• Forza di presa a 12 settimane: 336,8 ± 21,0 g contro 280,0 ± 37,8 g (p = 0,0008; normalizzata sul peso corporeo 10,3 contro 8,8 g/g, p = 0,012; n = 10 contro 14).
• Area dei macrofagi (F4/80) nel diaframma: 14,0% contro 19,5% (p = 0,013, n = 4 contro 3). La proporzione di macrofagi con il marcatore M2 CD206 nel tibiale anteriore è salita dal 17,6% al 55,5% (p inferiore a 0,0001).
• Cellule umane sono state trovate nel tibiale anteriore quattro settimane dopo il trattamento, occupando solo lo 0,0036% dell’area della sezione, ed erano scomparse a dieci settimane. La distrofina non è stata rilevata, quindi le cellule non hanno riparato il difetto di fondo.

A lungo termine (un anno, quattro o sei dosi, di solito aggregate):

• Infiltrazione di cellule mononucleate nel tibiale anteriore: 9,0% nei controlli, 7,3% dopo quattro dosi, 4,7% dopo sei; solo il gruppo con sei dosi ha raggiunto la significatività (p = 0,038, n = 4 per ciascun gruppo trattato contro 14). Nessuna differenza nel diaframma.
• Fibre con nuclei centrali, segno di ripetuta degenerazione e rigenerazione: 64,3% contro 82,0% (p = 0,014, n = 5 contro 7).
• La fibrosi non è diminuita nel tibiale anteriore, nel diaframma né nel cuore.
• Forza di presa: 296,5 ± 27,2 g contro 265,7 ± 26,3 g (p = 0,049; normalizzata 8,6 contro 7,3 g/g, p = 0,002; n = 8 contro 12). I topi wild-type hanno ottenuto 336,4 g, quindi i topi trattati si collocavano tra i due.
• La velocità massima di corsa non era diversa (21,6 contro 20,5 m/min, p = 0,77). La distanza giornaliera di corsa era maggiore (3.649 ± 1.025 contro 2.420 ± 788 m/giorno, p = 0,028, n = 8 contro 10), così come la distanza media al minuto (18,3 contro 14,7 m/min, p = 0,047, n = 5 contro 5).
• Cuore: nessuna differenza nella morfologia macroscopica, nella fibrosi o nella polarizzazione dei macrofagi, ma minore infiltrazione di cellule mononucleate (n = 6 contro 6) e frazione di accorciamento ventricolare sinistra più alta, 37,0 ± 2,3% contro 33,6% (p = 0,017; wild-type 39,6%). L’intestazione della Tabella 2 elenca 8 topi trattati mentre la nota a piè di tabella e la legenda della figura ne indicano 5, un’incongruenza dell’articolo stesso.

Conclusioni:

Gli autori concludono che il trattamento sistemico precoce e ripetuto con hAMSC ha ritardato l’infiammazione e il declino motorio nei topi mdx, probabilmente tramite la polarizzazione dei macrofagi M2 e non perché le cellule diventassero muscolo. Suggeriscono che potrebbe essere combinato con steroidi o con la terapia genica.

Limiti dichiarati dagli autori:

• La malattia cardiaca nei topi mdx è lieve rispetto ai pazienti, quindi i risultati cardiaci offrono informazioni limitate sull’uomo. Propongono di confermarli nel modello canino.
• Le cellule umane sono persistite solo per poco tempo e il modo in cui i fattori secreti producano effetti duraturi non è stabilito; il meccanismo resta da chiarire.
• La coltura e l’espansione prolungate delle MSC comportano rischi di senescenza e di alterazione cromosomica, e la capacità immunosoppressiva varia con la fonte tissutale.
• Dai metodi: gli sperimentatori non erano in cieco rispetto al ceppo, alcuni dati sono stati esclusi per giudizio e i gruppi a lungo termine erano piccoli.

Informazioni di contesto:

La Duchenne colpisce circa 1 nato maschio su 3.500. Gli steroidi sono il trattamento antinfiammatorio standard ma le risposte variano e gli effetti collaterali sono frequenti. Lo stesso gruppo aveva riferito in precedenza che cellule staminali della polpa dentale per via endovenosa ripetuta mantenevano l’attività locomotoria in topi mdx e cani distrofici. Gli autori osservano che le MSC somministrate per via endovenosa restano in gran parte intrappolate nei polmoni e vi muoiono, e che il loro effetto immunitario sembra derivare dal modo in cui i fagociti del ricevente rispondono alle cellule morenti. L’articolo non contiene dati su cellule derivate dal cordone ombelicale e non cita alcuno studio sull’uomo con cellule derivate dall’amnios per la Duchenne.