Terapia in vivo per la riparazione prenatale del mielomeningocele nel modello fetale ovino con cellule staminali mesenchimali derivate dal cordone ombelicale umano: prova di principio, sintesi dello studio

Punti principali e risultati:

Si tratta di uno studio su animali, in agnelli non ancora nati. Nessun essere umano è stato trattato. Un gruppo del Centro medico universitario di Amburgo-Eppendorf, in Germania, ha creato un difetto di spina bifida (mielomeningocele) nella colonna di agnelli fetali e lo ha poi riparato nell’utero, come fanno i chirurghi nella chirurgia fetale umana. In alcuni agnelli hanno prima posizionato cellule staminali mesenchimali (MSC) di cordone ombelicale umano direttamente sul midollo spinale esposto. Le cellule provenivano da Desacell, un prodotto pronto all’uso ricavato dal tessuto del cordone ombelicale di un unico neonato sano. Precedenti studi sulle pecore avevano usato cellule seminate su un patch, quindi questo è il primo resoconto dell’applicazione di una sospensione cellulare liquida in questo modo.

Lo studio ha mostrato che le cellule potevano essere applicate in tutti e cinque gli agnelli destinati a riceverle. Non ha potuto mostrare se le cellule fossero d’aiuto. Solo tre dei sette agnelli operati sono nati vivi (due trattati, uno non trattato), tutti e tre avevano punteggi motori normali o quasi normali, e l’agnello non trattato aveva addirittura la densità più alta di cellule nervose di grandi dimensioni sopravvissute. Gli autori stessi dicono che il campione era troppo piccolo per qualsiasi confronto tra gruppi.

Obiettivo:

L’obiettivo principale era verificare se un prodotto pronto all’uso di MSC di cordone ombelicale umano (Desacell) potesse essere applicato localmente sul midollo spinale durante la riparazione fetale della spina bifida nelle pecore. Gli obiettivi secondari erano capire se le cellule migliorassero il movimento sulla scala Sheep Locomotor Rating (SLR), se aumentassero le dimensioni del midollo spinale e della sua sostanza grigia, e se la densità delle cellule nervose di grandi dimensioni fosse legata al movimento.

Metodi:

Sono state usate pecore gravide di un unico allevatore, tutte con agnelli dello stesso montone. Lo studio è stato approvato dall’autorità del Land di Amburgo ai sensi della legge tedesca sulla protezione degli animali.

A circa 75 giorni di gravidanza (una gravidanza ovina dura circa 145 giorni), i chirurghi hanno aperto l’utero, rimosso la pelle, i muscoli della schiena e gli archi ossei della colonna da L1 a L5, e aperto la membrana che copre il midollo spinale. In questo modo il midollo resta esposto al liquido amniotico, come nella spina bifida. Circa 25 giorni dopo gli agnelli hanno subito un secondo intervento per riparare il difetto. Gli agnelli sono stati assegnati in rapporto di due a uno alla riparazione con o senza cellule. Nel gruppo con cellule il tessuto cicatriziale sopra il midollo spinale è stato rimosso e 1 mL di sospensione in gel di Desacell contenente 30 milioni di cellule è stato applicato direttamente sul midollo. Tutti gli agnelli hanno poi ricevuto un patch multistrato e la chiusura della pelle. Nelle gravidanze gemellari un gemello veniva trattato e l’altro fungeva da controllo o non veniva operato.

Le cellule provenivano da un unico cordone ombelicale donato, rispettavano i criteri internazionali di identità delle MSC ed erano testate per sterilità, micoplasma ed endotossine. Sono state scongelate, lavate, contate e spedite refrigerate (4 °C) alla sede dell’intervento.

Gli agnelli sono nati a termine e sono stati filmati a 2 e 48 ore dalla nascita. Valutatori che non sapevano quali agnelli avessero ricevuto le cellule hanno attribuito un punteggio al movimento sulla scala SLR a 15 punti, in cui 15 indica una deambulazione normale e 0-4 una compromissione grave. Gli agnelli sono stati poi soppressi e il midollo spinale lombare è stato tagliato in cinque-otto segmenti, colorato e misurato. Un neuropatologo, anch’egli in cieco, ha contato le grandi cellule nervose motorie per millimetro quadrato di sostanza grigia. Prima dello studio gli autori avevano calcolato che gruppi di tre e sei agnelli avrebbero dato una potenza di solo il 25,5%, il che significa che una differenza reale sarebbe molto probabilmente sfuggita.

Risultati:

Sopravvivenza: I difetti sono stati creati in 11 agnelli fetali in media a 76,9 giorni.

• Tre sono stati persi dopo il primo intervento. Una pecora ha sviluppato una deiscenza della ferita con occlusione intestinale ed è stata soppressa, un feto è morto dopo che la pecora aveva avuto la febbre e uno è morto il giorno di una complicanza della ferita.
• In un altro agnello il feto non era raggiungibile chirurgicamente, quindi sono stati riparati sette agnelli, in media a 104,3 giorni. Cinque hanno ricevuto le cellule e due no.
• Altri quattro feti sono morti da 11 a 17 giorni dopo la riparazione: tre dei cinque agnelli trattati e uno dei due non trattati. Uno aveva un ascesso fungino alla colonna con un’infezione fungina diffusa. La causa degli altri decessi non era chiara.
• Tre agnelli sono nati vivi tra 144 e 147 giorni: l’agnello 1 (senza cellule) e gli agnelli 3 e 4 (con cellule). L’articolo indica un tasso complessivo di nati vivi del 30%.

Movimento (scala SLR, su 15):

• L’agnello 1 (senza cellule) ha ottenuto 15 a 2 ore e 15 a 48 ore.
• L’agnello 3 (con cellule) ha ottenuto 13 a 2 ore e 15 a 48 ore.
• L’agnello 4 (con cellule) ha ottenuto 15 a 2 ore e 15 a 48 ore.

Tutti e tre gli agnelli camminavano quindi normalmente a 48 ore, con o senza cellule, e i punteggi non potevano mostrare alcun beneficio.

Tessuto del midollo spinale: In nessun agnello è stato visto un tumore, né a occhio nudo né al microscopio.

• La densità media delle cellule nervose di grandi dimensioni era di 20,4 per mm² nell’agnello non trattato, contro 15 e 13,1 per mm² nei due agnelli trattati. Gli autori osservano che è l’opposto di quanto trovato da studi precedenti.
• L’area media della sostanza grigia era più ampia negli agnelli trattati (274 e 218 unità, contro 171 nell’agnello non trattato), e la quota di midollo costituita da sostanza grigia era 0,32 e 0,48, contro 0,31. Gli autori ipotizzano che ciò “potrebbe forse indicare una migliore conservazione del tessuto”.
• Le aree sono state misurate in pixel dell’immagine e non sono stati riportati test statistici di confronto tra gli agnelli.

Conclusioni:

Gli autori concludono che applicare un prodotto di MSC di cordone ombelicale umano durante la riparazione fetale della spina bifida nelle pecore è fattibile, e che servono studi più ampi con Desacell per verificare movimento, protezione nervosa e sicurezza.

Lo studio è un primo passo tecnico. Hanno potuto essere valutati solo un agnello non trattato e due trattati, quindi i risultati non possono mostrare se le cellule funzionano. Gli autori elencano tre limiti principali: l’alta mortalità fetale, che ha eliminato ogni possibilità di un confronto significativo e può riflettere problemi chirurgici non legati alle cellule; l’assenza di colorazioni specifiche (immunoistochimica), per cui non hanno potuto confermare che le cellule fossero ancora presenti nell’area riparata; e troppo pochi sopravvissuti perché i punteggi motori avessero un significato. Inoltre l’agnello non trattato camminava normalmente, il che fa pensare che in questo modello il difetto non abbia causato una debolezza duratura in questi animali, e con un agnello per confronto le differenze di sostanza grigia e di cellule nervose potrebbero facilmente essere dovute al caso. Esiti a lungo termine come la funzione vescicale o il midollo ancorato non sono stati studiati, perché gli agnelli sono stati esaminati solo fino a 48 ore dalla nascita.

Informazioni di contesto:

In Europa la spina bifida colpisce circa 1 gravidanza su 2.000. Lo studio MOMS ha mostrato che riparare il difetto prima della nascita dimezza la necessità di uno shunt per il liquido cerebrale e raddoppia la probabilità di camminare a 30 mesi, ma il 58% dei bambini operati prima della nascita non riesce ancora a camminare in autonomia. I ricercatori sperano che aggiungere cellule staminali al momento della riparazione possa proteggere ulteriormente il midollo spinale esposto.

Il prodotto cellulare, Desacell, è descritto come un prodotto pronto all’uso ottenuto con un protocollo di isolamento brevettato. L’articolo non indica il produttore né il titolare del brevetto. Gli autori dichiarano che è stato testato in roditori e in babbuini prematuri, in adulti con grave insufficienza polmonare (CIRCA-19), in neonati pretermine a rischio di malattia polmonare cronica (HULC-1), ed è in studio in adulti con shock settico (UC-CISS II). Lo studio sui babbuini che citano, guidato dal coautore Möbius, si intitola “Prophylactic administration of mesenchymal stromal cells does not prevent arrested lung development in extremely premature-born non-human primates”. Due degli autori appartengono al Saxonian Center for Feto/Neonatal Health della Technische Universität Dresden.

Lo studio è stato finanziato dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG BA 7308/4-1). Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse. Il lavoro è solo un esperimento su animali, e gli autori indicano lo studio CuRe in corso, che usa cellule placentari su un patch, come il primo studio sull’uomo con cellule staminali somministrate durante la riparazione fetale della spina bifida.