Sicurezza ed efficacia delle cellule stromali mesenchimali derivate dal cordone ombelicale umano nella riparazione fetale del mielomeningocele ovino, sintesi dello studio

Punti principali e risultati:

Questo studio preclinico è stato condotto su feti di pecora. Nessun bambino è stato trattato. Un gruppo francese di Parigi sta preparando un programma di chirurgia fetale che aggiunge cellule stromali mesenchimali derivate dal cordone ombelicale (UC-MSC) alla riparazione prenatale del mielomeningocele. L’articolo riporta il loro primo test con UC-MSC umane, un tipo di cellule ampiamente usato nella terapia cellulare clinica, posizionate sul midollo spinale di agnelli fetali.

Gli agnelli che hanno ricevuto le cellule avevano all’istologia un midollo spinale meglio conservato, e la differenza era statisticamente significativa. Tendevano anche a muoversi meglio, anche se i risultati motori non hanno raggiunto la significatività statistica. Sono nati vivi solo nove agnelli, studiati per 24 ore. Quasi la metà di tutti i feti operati è stata persa. Gli autori dichiarano che il trasferimento all’uomo deve attendere dati a più lungo termine sugli animali.

Obiettivo:

Valutare la sicurezza e l’efficacia di un patch di fibrina contenente UC-MSC umane, usato in aggiunta alla riparazione chirurgica fetale del mielomeningocele nel modello ovino.

Metodi:

Le UC-MSC sono state isolate con il metodo dell’espianto da tre cordoni ombelicali umani, donati con consenso da donne dopo un parto vaginale. Le cellule rispondevano alla definizione della International Society for Cellular Therapy. Aderivano alla plastica, erano fusiformi, positive per CD73, CD90 e CD105 e negative per CD45, CD11b, CD14, CD34 e CD79a.

Il patch è stato preparato il giorno prima dell’intervento con un kit commerciale di sigillante di fibrina (Evicel). Per il patch cellulare, 17 milioni di UC-MSC al passaggio 5 sono state miscelate nella soluzione di fibrinogeno prima della solidificazione con trombina in una piastra. I patch di controllo erano identici ma non contenevano cellule. Alla microscopia time-lapse le cellule si muovevano liberamente nel patch e assumevano in 72 ore la loro normale forma fusiforme.

Negli agnelli fetali è stato creato chirurgicamente un difetto spinale al 75° giorno di gestazione (laminectomia L1-L5 con rimozione della dura madre). È stato riparato 14 giorni dopo, all’89° giorno, posando il patch sul midollo spinale e chiudendo sopra di esso la pelle fetale. Le pecore sono state controllate ogni giorno per condizioni generali, temperatura e guarigione della ferita. Gli agnelli sono nati con taglio cesareo al 142° giorno.

Un veterinario all’oscuro del tipo di patch ha valutato il movimento a 2 e 24 ore di vita con la Sheep Locomotor Rating scale (0 indica paraplegia completa, 15 normalità). Gli agnelli sono stati poi soppressi. Tutti gli organi principali sono stati esaminati a occhio nudo e al microscopio alla ricerca di tumori. A livello L3-L4 della riparazione il gruppo ha misurato l’area del midollo spinale, l’area della sostanza grigia, il numero di neuroni di grandi dimensioni (motoneuroni) per millimetro quadrato di sostanza grigia e lo spessore del tessuto cicatriziale. I gruppi sono stati confrontati con il test U di Mann-Whitney.

Risultati:

Un difetto è stato creato in 17 feti. Due sono nati morti prima della riparazione, quindi ne sono stati riparati 15, 8 con patch cellulare e 7 con patch di controllo. Dopo la riparazione ne sono stati persi 2 su 8 nel gruppo con cellule e 4 su 7 nel gruppo di controllo. La perdita fetale complessiva è stata del 47% (8 su 17). In totale sono nati vivi 9 agnelli, 6 con cellule e 3 di controllo.

Sicurezza: Nessuna pecora ha sviluppato febbre o altre complicanze, e non c’erano segni di rigetto delle cellule umane. La riparazione era completamente guarita in tutti e nove gli agnelli, senza perdite di liquido cerebrospinale né infezioni. Non è stato trovato alcun tumore in nessun agnello all’esame clinico né in nessun organo, 54 giorni dopo il posizionamento delle cellule. Nessun agnello presentava erniazione del romboencefalo.

Movimento:

• Punteggio locomotorio a 2 ore: mediana 4,0 (intervallo 0-13) con cellule contro 2,0 (0-5) senza, p = 0,32.
• Punteggio locomotorio a 24 ore: mediana 15,0 (intervallo 2-15) con cellule contro 2,0 (2-5) senza, p = 0,07.
• Capacità di stare in piedi senza aiuto: 3 su 5 con cellule, 0 su 3 senza, p = 0,08.
• Atrofia muscolare: 1 su 6 con cellule, 2 su 3 senza, p = 0,13.

Nessuna di queste differenze raggiunge la soglia convenzionale di p inferiore a 0,05. Almeno un agnello trattato ha ottenuto solo 2 punti, non meglio dei controlli.

Midollo spinale al microscopio:

• Densità dei neuroni di grandi dimensioni: 9,9 per mm² di sostanza grigia con cellule contro 6,3 senza (p = 0,04).
• Area della sostanza grigia: 6,2 contro 1,9 mm² (p = 0,01).
• Area del midollo spinale: 16,1 contro 7,5 mm² (p = 0,02).
• Spessore della cicatrice attorno al midollo: 70,9 contro 253,7 micrometri (p = 0,10). Spessore della cicatrice nel sito di riparazione: 691,3 contro 1.684,4 micrometri (p = 0,18). Entrambi erano più bassi con le cellule, senza raggiungere la significatività.

L’abstract descrive i punteggi locomotori come medie. La tabella dei risultati nel corpo dell’articolo li indica come mediane con intervalli, il che corrisponde anche al test statistico usato. Questa sintesi segue la tabella.

Conclusioni:

Gli autori concludono che le UC-MSC umane usate insieme alla chirurgia fetale del mielomeningocele erano sicure nelle pecore, che le cellule sembrano agire attraverso le sostanze che secernono più che trasformandosi in tessuto nervoso o diffondendosi nell’organismo, e che l’uso nell’uomo “sarà preso in considerazione dopo la conferma di questi risultati di sicurezza su un periodo più lungo nel modello animale”.

Limiti indicati dagli autori:

• Numeri piccoli in ciascun gruppo, con probabile mancanza di potenza statistica.
• Un alto tasso di perdita fetale, anche se simile a quello di altri interventi di chirurgia fetale su animali di grandi dimensioni. In una revisione di 232 agnelli del principale gruppo statunitense la sopravvivenza era solo del 43%.
• Per motivi economici gli agnelli non hanno potuto essere tenuti in vita oltre 24 ore, quindi non si sa nulla della sicurezza o della funzione a medio o lungo termine. È in corso uno studio di follow-up a 1 e 6 mesi di vita.
• Il beneficio era minore rispetto ai precedenti esperimenti del gruppo con UC-MSC di pecora. Gli autori sospettano una variabilità tra donatori, perché i tre cordoni usati potrebbero non essere stati buoni produttori di fattori protettivi. Stanno testando due rimedi: unire cellule di più donatori e un test di potenza per selezionare donatori con alta secrezione.

Informazioni di contesto:

Gli autori osservano che, anche dopo la chirurgia fetale, il 71% dei bambini non riesce a camminare in autonomia a otto anni e il 75% ha bisogno del cateterismo urinario quotidiano a dieci anni. Per questo diversi gruppi stanno aggiungendo cellule all’intervento. Un gruppo californiano che usa cellule derivate dalla placenta ha avviato uno studio sull’uomo. Il gruppo francese dice di essere l’unico a usare cellule del cordone ombelicale.

Nel lavoro di laboratorio del gruppo, le UC-MSC umane secernono il fattore neurotrofico derivato dal cervello e il fattore di crescita degli epatociti, che proteggono le cellule nervose, e fattori antifibrotici. In un precedente studio di tracciamento con cellule fluorescenti, le cellule trapiantate non hanno raggiunto organi distanti.

Per la sicurezza nell’uomo, gli autori rimandano a due ampie meta-analisi di studi randomizzati con UC-MSC per altre condizioni, per lo più somministrate per via endovenosa ad adulti e bambini, in cui una febbre transitoria era l’unico evento avverso legato alle cellule e non sono stati riportati tumori. Nessuno di questi dati proviene dall’uso in un feto, e gli autori riconoscono che per le UC-MSC questo non è mai stato studiato.