Cellule stromali mesenchimali allogeniche derivate dal cordone ombelicale migliorano la funzione motoria nella riparazione chirurgica prenatale del mielomeningocele: studio su modello ovino, sintesi dello studio

Punti principali e risultati:

Questo studio preclinico è stato condotto su feti di pecora. Nessun bambino è stato trattato. Un gruppo francese di Parigi, che si prepara ad aggiungere cellule stromali mesenchimali derivate dal cordone ombelicale (UC-MSC) alla riparazione chirurgica prenatale del mielomeningocele, ha posizionato durante la riparazione un patch di fibrina con UC-MSC di pecore donatrici sul midollo spinale esposto di agnelli fetali. Gli agnelli riparati con il patch cellulare sono stati confrontati con agnelli riparati con lo stesso patch senza cellule.

Un giorno dopo la nascita, gli agnelli che avevano ricevuto le cellule si muovevano meglio, nessuno di loro perdeva urina e al microscopio il loro midollo spinale presentava più cellule nervose di grandi dimensioni e molto meno tessuto cicatriziale. Queste differenze erano statisticamente significative. Altre misure, tra cui gli esami di conduzione nervosa, le dimensioni dei muscoli e lo spessore degli sfinteri, non hanno mostrato differenze. Sono nati vivi solo nove agnelli, seguiti per 24 ore, quindi lo studio non dice nulla sugli effetti o sulla sicurezza a più lungo termine.

Obiettivo:

Studiare l’effetto di un patch di UC-MSC allogeniche (da donatore) applicato durante la chirurgia fetale sulla funzione motoria e sfinterica a 24 ore di vita nel modello ovino di mielomeningocele.

Metodi:

Lo studio è stato approvato dal Comitato nazionale francese per la ricerca animale e ha seguito le linee guida ARRIVE per la ricerca sugli animali.

Le UC-MSC sono state coltivate con il metodo dell’espianto dai cordoni ombelicali di tre agnelli nati con taglio cesareo vicino al termine. Le cellule erano fusiformi, aderivano alla plastica e portavano i marcatori MSC ovini CD29, CD90, CD73, CD44 e CD166, ma non CD31 né CD45. Per ogni patch cellulare, 17 milioni di cellule al passaggio 5 sono state miscelate con il fibrinogeno di un kit commerciale di sigillante di fibrina (Evicel) e fatte solidificare con trombina. I patch di controllo sono stati preparati allo stesso modo senza cellule. Entrambi i tipi erano flessibili e spessi circa 2 mm.

Negli agnelli fetali è stato creato chirurgicamente un difetto spinale al 75° giorno di gestazione (laminectomia L1-L5 con rimozione della dura madre), riparato all’89° giorno. Il patch è stato posato sul midollo spinale e la pelle fetale è stata chiusa sopra di esso. I chirurghi sapevano quale patch veniva usato. Gli agnelli sono nati con taglio cesareo tra il 140° e il 142° giorno e sono stati tenuti in vita per 24 ore.

A 2 e 24 ore di vita un medico fisiatra pediatrico e un chirurgo veterinario, entrambi all’oscuro del gruppo, hanno valutato il movimento con la Sheep Locomotor Rating scale (SLR, da 0 per paralisi completa a 15 per normale), oltre alla stazione eretta, ai riflessi, alla sensibilità e all’atrofia muscolare (amiotrofia). Un agnello era considerato continente se assumeva una normale postura di minzione e non perdeva urina alla pressione sulla vescica. A 24 ore, in anestesia, un neurologo veterinario all’oscuro del gruppo ha registrato l’attività elettrica muscolare, la conduzione nervosa e i potenziali evocati spinali, e una TC della colonna ha misurato le dimensioni del difetto. Gli agnelli sono stati poi soppressi. Un neuropatologo all’oscuro del gruppo ha misurato l’area del midollo spinale, l’area della sostanza grigia, la densità dei neuroni di grandi dimensioni e lo spessore del tessuto cicatriziale (fibrosi), e tutti gli organi principali sono stati esaminati alla ricerca di tumori.

Lo studio era stato pianificato con quattro agnelli per gruppo, ipotizzando che il 90% degli agnelli trattati e il 10% dei controlli avrebbe superato 12 punti alla SLR. I gruppi sono stati confrontati con il test U di Mann-Whitney e con il test del chi quadrato.

Risultati:

I patch sono stati posizionati in 13 feti. Quattro sono stati persi: due aborti (uno per gruppo) e due morti fetali, una scoperta al momento della riparazione e una, di un feto trattato, al parto cesareo. La perdita fetale complessiva è stata del 31%. Sono nati vivi nove agnelli, 5 con patch cellulare e 4 con patch di controllo.

Sicurezza: Tutte e nove le riparazioni erano completamente guarite. Nessun agnello presentava erniazione del romboencefalo e non è stato trovato alcun tumore in nessun organo. Le cause delle quattro perdite fetali non hanno potuto essere determinate perché l’autopsia non era possibile.

Movimento:

• SLR a 2 ore: mediana 2 (intervallo 1-7) con cellule contro 2 (1-6) senza, p = 0,83.
• SLR a 24 ore: mediana 14 (intervallo 13-15) con cellule contro 5 (4-14) senza, p = 0,04.
• Capacità di stare in piedi senza aiuto: 5 su 5 con cellule, 2 su 4 senza, p = 0,07 (non significativo).
• Atrofia muscolare degli arti posteriori: 0 su 5 con cellule, 3 su 4 senza, p = 0,02.

Continenza: Nessuno dei 5 agnelli trattati era incontinente, contro tutti e 4 gli agnelli di controllo (p = 0,002). Gli autori osservano che si trattava di un semplice giudizio clinico, non confermato da esami vescicali o istologici.

Esami nervosi e TC della colonna: L’attività elettrica muscolare spontanea, le ampiezze e le velocità di conduzione nervosa e i potenziali evocati spinali non differivano in modo significativo tra i gruppi. Le TC della colonna mostravano difetti di dimensioni e angolazione spinale simili nei due gruppi.

Midollo spinale al microscopio:

• Densità dei neuroni di grandi dimensioni: 14,5 per mm² di sostanza grigia con cellule contro 5,6 senza (p = 0,001).
• Tessuto cicatriziale tra midollo spinale e pelle: 453 contro 3.921 micrometri di spessore (p = 0,03).
• Tessuto cicatriziale attorno al midollo spinale: 47 contro 158 micrometri di spessore (p = 0,0001).
• L’area della sostanza grigia (8,2 contro 7,1 mm², p = 0,74) e l’area del midollo spinale (21,8 contro 16,7 mm², p = 0,44) non differivano in modo significativo.

Muscoli e sfinteri: Il peso e le dimensioni delle fibre di due muscoli degli arti posteriori, e lo spessore degli sfinteri urinario e anale, erano simili nei due gruppi.

L’articolo presenta alcune incongruenze di rendicontazione. Il testo definisce “medi” diversi risultati, mentre le tabelle e i metodi riportano mediane. Alcuni intervalli nella tabella dei reperti extraspinali non possono essere corretti (per esempio una mediana di controllo di 13,7 con un intervallo da 45,3 a 49,4), e la tabella della TC della colonna ripete i numeri delle righe sul peso muscolare. Questo non incide sui risultati principali sopra riportati.

Conclusioni:

Gli autori concludono che i patch di UC-MSC usati insieme alla riparazione prenatale del mielomeningocele nelle pecore “migliorano le funzioni motorie e sfinteriche”, insieme a una migliore conservazione del midollo spinale e a una minore fibrosi, e che servono altri studi sulla sicurezza a lungo termine e sulla possibilità di trasferire l’approccio all’uomo.

Limiti indicati dagli autori:

• Campione piccolo, in parte a causa della perdita fetale, frequente in questo modello animale.
• Follow-up di sole 24 ore, perché la cura di agnelli potenzialmente disabili è costosa e complessa, il che limita le conclusioni su efficacia, tollerabilità e sicurezza.
• Una misura soggettiva della continenza, non confermata istologicamente.
• Gli esami di conduzione nervosa e dei potenziali evocati non hanno mostrato differenze, forse perché lo studio era troppo piccolo o perché i circuiti nervosi differiscono tra pecora e uomo.

Anche altri punti invitano alla cautela. I chirurghi non erano in cieco. La capacità di stare in piedi non era significativamente diversa. Il risultato motorio a 24 ore si basa su 5 contro 4 animali, e un agnello di controllo ha ottenuto 14 punti, lo stesso valore della mediana dei trattati.

Differenze rispetto allo studio del gruppo con cellule umane: Lo stesso gruppo ha poi ripetuto l’esperimento con UC-MSC da cordoni ombelicali umani (sintesi dello studio). In questo studio precedente le cellule provenivano da pecore, movimento e continenza differivano in modo significativo a 24 ore e il tessuto cicatriziale era ridotto in modo significativo, mentre l’area del midollo spinale e della sostanza grigia non differiva. Nello studio con cellule umane il quadro era quasi invertito. L’area del midollo spinale, l’area della sostanza grigia e la densità neuronale erano significativamente migliori, ma i risultati motori e la riduzione del tessuto cicatriziale non hanno raggiunto la significatività. Gli autori dello studio successivo hanno ipotizzato che i tre cordoni umani donatori potessero produrre meno fattori protettivi. Entrambi gli studi erano piccoli e hanno seguito gli agnelli per sole 24 ore.

Informazioni di contesto:

Gli autori osservano che, anche dopo la chirurgia fetale, il 71% dei bambini con mielomeningocele non riesce a camminare in autonomia a otto anni e il 75% ha bisogno di cateterismo urinario quotidiano entro i dieci anni. Il precedente esperimento del gruppo sulle pecore aveva trovato solo un effetto piccolo e non significativo delle UC-MSC sul movimento a 2 ore di vita, un momento che gli autori ritengono troppo vicino alla nascita per giudicare.

Un gruppo californiano che usava MSC placentari di inizio gestazione su una matrice suina nello stesso modello ha riportato una SLR mediana di 15 con cellule contro 6 senza, e più neuroni conservati. Quel gruppo non ha trovato differenze nella funzione vescicale, quindi il risultato sulla continenza qui riportato è nuovo e non confermato.

Gli autori ritengono che le UC-MSC agiscano soprattutto rilasciando fattori di crescita e protettivi più che trasformandosi in cellule nervose, ma dichiarano che i meccanismi esatti non sono ancora noti. Ipotizzano che la riduzione del tessuto cicatriziale possa essere rilevante per il midollo ancorato, un problema frequente dopo la riparazione del mielomeningocele. In un precedente studio di tracciamento del gruppo, le cellule trapiantate non sono state trovate in organi distanti.

Lo studio è stato finanziato da due enti benefici francesi per la ricerca medica, la Fondation de l’Avenir e la Fondation pour la Recherche Médicale. Gli autori non hanno dichiarato conflitti di interesse. La rivista ha pubblicato un commento di accompagnamento di Anna L. David.